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| 掌握配制培养基制备、灭菌与消毒的一般方法和步骤 | |||
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实验目的：1.了解培养基的配制原理；2.掌握配制培养基的一般方法和步骤。
培养基是人工配制的，适合微生物生长繁殖或产生代谢产物的营养基质。
原则：目的明确 ;营养协调;控制PH、渗透压等条件;经济节约。
方法：查阅文献;精心设计;试验比较。
步骤：称量、熔化、调PH、过滤、分装、加塞、包扎、灭菌、冷却、无菌检查。
培养基种类:
碳源、氮源、能源、生长因子、无机盐、水。
一、按成份的不同划分：天然培养基、合成培养基、半合成培养基。
二、按培养基的物理状态划分：固体培养基、液体培养基、半固体培养基。
三、按培养基用途划分：基础培养基、加富培养基、鉴别培养基、选择培养基。
牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基。其配方如下：
牛肉膏3g，蛋白胨10g，Nacl5g，琼脂15～20g，水1000mL，PH7.0～7.2(后调)。
高氏1号培养基：高氏1号培养基是用于分离和培养放线菌的合成培养基。其配方如下：
可溶性淀粉20g，KNO3 1g，NaCl 0.5g，K2HPO4·3H2O 0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，琼脂15～20g，水1000mL，pH7.4～7.6。
查氏合成培养基：查氏合成培养基是用来分类和培养霉菌的培养基,其配方如下：
NaNO3 3g,K2HPO4 1g, KCl 0.5g,
MgSO4.7H2O 0.5g,FeSO4 0.01g,蔗糖 30g, H2O 1000ml,pH自然
麦芽汁培养基：用来培养酵母菌,干麦芽粉加4倍水,在50-60℃保温糖化3-4小时，用碘液试验检查至糖化完全为止,调整糖液浓度,煮沸后，过滤，调pH为6.0。
消毒与灭菌
消毒：消灭病原菌和有害微生物的营养体。
灭菌：杀灭一切微生物的营养体，芽胞和孢子。
方法：
物理的方法：加热、过滤、辐射
化学的方法：用化学试剂抑制或杀灭微生物。主要破坏细菌代谢机能。如重金属离子，磺胺类药物及抗生素等。
加热法：
干热法：火焰灼烧灭菌和热空气灭菌
1、火焰灼烧适用于接种环、接种针和金属用具如镊子等，试管口和瓶口，涂布用玻璃棒。
2、热空气灭菌利用高温干燥空气（160－170C）加热灭菌1－2h，适用于玻璃器皿和培养皿等。原理加热使蛋白质变性，与水的含量有关，当环境和细胞含水量越大，凝固越快。
3、注意事项：
1）培养基、橡胶制品、塑料制品不能用此法；
2）温度控制在<180°；
3）物品不能太挤；
4）温度降至70°时才开箱门。
湿热法 ：
原理：因为湿热中菌体吸水，蛋白质容易凝固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低；湿热的蒸气有潜热存在。所以效果比同温度下干热好。
高压蒸汽灭菌法：
1、设备：高压灭菌锅
2、时间长短根据灭菌物品的种类和数量不同有所变化。
3、适用于培养基、工作服、橡胶物品等的灭菌，也可用于玻璃器皿的灭菌。
4、注意事项：
1）冷空气彻底排除；2）加水；3）压力降为“0”时方可打开。
在使用高压蒸气灭菌锅灭菌时，灭菌锅内冷空气的排除是否完全极为重要，因为空气的膨胀压大于水蒸气的膨胀压，所以，当水蒸气中含有空气时，在同一压力下，含空气蒸气的温度低于饱和蒸气的温度。灭菌锅内留有不同分量空气时，压力与温度的关系见表2
压力与温度的关系表
常压蒸汽灭菌：对于不宜用高压蒸汽灭菌的培养基如明胶培养基、牛乳培养基，含糖培养基等可采用此法。彻底灭菌则采用间歇灭菌方法。
煮沸灭菌法：适用注射器和解剖器皿，时间10－15min。
超高温杀菌：135-150°C和2-8s对牛乳和其它液态食品灭菌。
优点 ：保持食品价值和营养成分。
过滤除菌原理：介质在有压力时阻隔微生物。
适用范围：许多材料如血清、抗生素及糖溶液采用此法。
设备：蔡氏过滤器，滤膜过滤器。
优缺点：不破坏培养基成分，只适用少量滤液。
注意事项：1、压力适当；2、无菌条件下进行；3、防止渗透现象。
辐射灭菌原理：紫外线波长在200－300nm，具有杀菌作用，以265-266杀菌力强。此段波长易被细胞中核酸吸收；可产生臭氧和过氧化氢。杀菌效力与强度和时间的乘积成正比。
缺点：穿透力不大。距照射物<1.2m为宜。
应用：无菌室，医院。
注意事项：对眼睛和皮肤有刺激作用。
化学药品灭菌原理：应用化学制剂破坏细菌代谢机能。
杀菌剂如重金属离子；抑菌剂如磺胺类及多数抗生素。
注意：与药品的浓度高低，时间长短，微生物种类以及微生物所处的环境有关。
常用化学杀菌剂有：乙醇、醋酸、石碳酸
福尔马林、升汞、高锰酸钾、新洁尔灭等。
微生物的分离、纯化及培养技术
分离与纯化：从混杂的微生物群体中获得只含某一种或某一株微生物的过程。
为什么要进行纯培养：平板上的单一菌落并不 一定保证是一种菌。
常用的分离、纯化方法：单细胞挑取法、稀释涂布平板法、稀释混合平板法、平板划线法。
稀释涂布平板法 ：
步骤： 1、倒平板：牛肉膏蛋白胨培养基，高氏I号培养基，查氏培养基冷却至55-60℃时，混匀后倒平板，牛肉膏蛋白胨培养基倒4皿，高氏I号培养基和查氏培养基各倒3皿。2、制备污水稀释液：10g土样，加入90ml无菌水中，在三角瓶中振摇20min。取0.5ml 加入盛有4.5ml无菌水的试管中，以此类推，制成不同稀释度。3、涂布：将上述每种培养基平板底面标记稀释度，然后用无菌吸管从最后三种稀释度，即10-4、10-5和10-6的试管中吸取0.1ml对号放入平板上，用玻棒涂布。4、培养：高氏I号和查氏倒置培养于28℃培养箱中培养3-5days，牛肉膏蛋白胨琼脂培养基在37℃培养1-2days。5、挑菌落：转至斜面，检查是否一致，保存。
平板划线法：
1、倒平板，标记培养基名称，编号和实验日期。
2、划线方法
稀释混合平板法 ：
1、先加菌
2、倒平板时注意培养基温度
3、混合均匀。
微生物培养技术
1、斜面接种
2、液体培养基接种
3、穿刺接种
将已接种的斜面、半固体和液体培养基放置培养箱中培养将生长好的菌种用牛皮纸包好，置4℃冰箱中保存。
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