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| 微生物实验用菌种如何保存的方法（一） | |||
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1. 菌种采集。实验室用菌种一是到国家法定机构采购，二是购买ATCC菌种，三是科研中菌种交流。不管是哪种来源，均由公司统一采集。采集中严格按照规范执行。要求包装可靠，采集迅速，不泄漏不污染。保证菌种合格和环境安全。采集中要有菌种传代标识。
2.菌种的活化：购买的标准菌种必须要求是冻干粉，科研中菌种交流可以为斜面或液体。
方法：①胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)，非选择性羊血琼脂，PCA或营养琼脂，35℃正常环境培养24-48小时。②非选择性羊血琼脂，35℃正常环境培养24-48小时。③巧克力琼脂平板，35℃5-10%CO2环境培养24-48小时。④ CDC厌氧血琼脂35℃厌氧培养48-72小时；部分专性厌氧菌能需要5-7天，才能充分生长；对于梭菌，以下新鲜培养基也可选用：营养琼脂，TSA琼脂，PCA琼脂，需培养48-96小时。⑤沙堡氏葡萄糖Emmons琼脂25-28℃培养3-7天；也可用PDA琼脂。⑥巧克力琼脂平板，35℃微需氧环境培养48-72小时。⑦ 改良罗氏琼脂或Middlebrook琼脂，35℃5-10%CO2或正常环境培养7天。⑧ 缓冲活性碳酵母提取物琼脂，35℃正常环境培养3-5天。⑨巧克力琼脂平板，35℃5-10%CO2环境培养48小时。⑩ 先用脑心浸出液肉汤或TSB培养基35℃增菌培养18-24小时，再划线至TSA琼脂35℃正常环境培养24-48小时。11、先接种于MRS肉汤35℃增菌培养24-48小时，再划线接种至含羊血的哥伦比亚CNA培养基35℃5%CO2环境培养24-48小时。12、 PDA琼脂45℃正常环境培养48-72小时。13、 先接种于10B精氨酸肉汤，作系列梯度稀释35℃正常培养至培养基变成粉红色，接入A-8琼脂。
3.菌种保存。所有菌种均由实验室专人(双人双锁)保存于专用冰箱或其它保存方式。要建立菌种登记台帐，详细记录菌种采集、保管、制备、使用、处置情况；每一种菌种一定要有本公司的检测鉴定报告（具体的的鉴定方法见ATCC提供的菌种证书方法）；具体菌种保存方法如下：
3.1 干粉菌种：购买的干粉菌种保存于2-8℃冰箱中，可保存3-5年。
3.2 斜面菌种或液体菌种：
3.2.1 液氮罐保存方法：用于第一代菌种的长期保存，每种菌种保存5管。
（1）准备用于液氮保藏的安瓿管或菌种保存管(塑料)，要求能耐受温度突然变化而不致破裂，因此，需要采用硼硅酸盐玻璃制造的安瓿管，安瓿管的大小通常使用75×10mm的，或能容1．2mm液体的。
（2）加保护剂与灭菌保存细菌、酵母菌或霉菌孢子等容易分散的细胞时，则将空安瓿管塞上棉塞， 121℃灭菌15分钟：若作保存霉菌菌丝体用则需在安瓿管内预先加入保护剂如10％的甘油蒸馏水溶液或10％二甲亚砜蒸馏水溶液，加入量以能浸没以后加入的菌落圆块为限，而后再用121℃灭菌15分钟。
（3）接入菌种：将菌种用10％的甘油蒸馏水溶液制成菌悬液，装入已灭菌的安瓿管；霉菌菌丝体则可用灭菌打孔器，从平板内切取菌落圆块，放入含有保护剂的安瓿管内，然后用火焰熔封。浸入水中检查有无漏洞。
（4）冻结再将已封口的安瓿管以每分钟下降1℃的慢速冻结至-30℃。若细胞急剧冷冻，则在细胞内会形成冰的结晶，因而降低存活率。
（5）保藏经冻结至-30℃的安瓿管立即放入液氮冷冻保藏器的小圆筒内，然后再将小圆筒放入液氮保藏器内。液氮保藏器内的气相为-150℃，液态氮内为-196℃。
（6）恢复培养保藏的菌种需要用时，将安瓿管取出，立即放入38-40℃的水浴中进行急剧解冻，直到全部融化为止。再打开安瓿管，将内容物移入适宜的培养基上培养。
此法除适宜于一般微生物的保藏外，对一些用冷冻干燥法都难以保存的微生物如支原体、衣原体、氢细菌、难以形成孢子的霉菌、噬菌体及动物细胞均可长期保藏，而且性状不变异。下一页：微生物实验用菌种如何保存的方法（二）
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